質(zhì)粒DNA提取可以：（1）快速純化質(zhì)粒；（2）用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法原理

質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。
 

提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：

①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增

②細(xì)菌菌體的裂解

③質(zhì)粒DNA的純化

實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌

試劑、試劑盒

Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc異丙醇溶菌酶酚:氯仿無(wú)水乙醇LB培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)步驟

一、材料與試劑準(zhǔn)備
 

1.  材料：大腸桿菌。
 

2.  儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀。
 

3.  試劑：
 

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。
（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無(wú)水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。
 

二、操作步驟
 

1.  細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過(guò)夜。
 

2.  離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。
 

3.  沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
 

4.  重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。
 

5.  加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
 

6.  加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。
 

7.  加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。
 

8.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。
 

9.  取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。
 

10.  加入40 ul，3 M NaAc。
 

11.  酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
 

12.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。
 

13.  取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
 

14.  電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。

閱讀：  2016-12-20 10:08:47