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E+ Rosetta（gamiB）感受態(tài)細(xì)胞說明書

（Rev.A）

保存：-80℃保存，運(yùn)輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-80℃保存至少6個月。

產(chǎn)品簡介：

本公司生產(chǎn)的E⁺Rosetta（gamiB）感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌Rosetta（gamiB）菌株經(jīng)特殊工藝制備得到，具有無需繁瑣的冰浴、熱擊程序，簡單快速的進(jìn)行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。使用pUC19 質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá) 2×10⁷cfu/μg，-80℃保存3-5 個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

基因型: F-ompThsdSB(rB- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) pRARE (argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL) (CmR)

特 點(diǎn): 一種用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷的抑制型菌株。其φ80 lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與 pUC 載體編碼的 β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn) β 互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。

操作方法：（以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

1.     將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，以下實(shí)驗(yàn)以 100μl感受態(tài)細(xì)胞為例。

2.     向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的 DNA，注意目的 DNA 的體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。

3.     室溫靜置5-10min。

4.     向離心管中加入 900μl 無菌無抗的 SOC（本試劑盒提供） 或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 180rpm 振蕩培養(yǎng) 30分鐘到1小時。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

5.     取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含相應(yīng)抗生素的 SOC 或 LB 平板，37℃倒置培養(yǎng) 12-16小時或過夜培養(yǎng)。涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整，如轉(zhuǎn)化的 DNA 總量較多，可取200μl 左右的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如轉(zhuǎn)化的 DNA 總量較少，可4℃，2500g離心5min后，棄去上清約700μl，用剩余約200-300μl 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過多菌液可以抑制細(xì)菌生長。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。

注意事項(xiàng)：

1.     感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會降低。

2.     實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，防止其它 DNA 或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。

3.     轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA 量過多或體積過大反而會降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時 DNA 體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。

4.     轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板 DNA 總量。

5.     為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最低。