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2×Magic⁺PfuPreMIX說明書

（Rev.C）

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品說明：本產(chǎn)品包含Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反應(yīng)緩沖液、電泳指示染料，濃度為2×。具有超高保真性、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，無需額外添加Loading Buffer等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的減少使用者的工作強(qiáng)度，減少人為誤差。使用時(shí)只需加入DNA模板和引物并補(bǔ)足所需要的水即可。

產(chǎn)品內(nèi)容：Pfu DNA Polymerase ：0.05units/?l ；MgCl₂： 4mM ；dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)：0.2mM；指示染料：0.05%。

質(zhì)量控制： SDS-PAGE檢測純度大于99%；經(jīng)檢測無外源核酸酶活性；PCR方法檢測無宿主殘留DNA；能有效擴(kuò)增人類基因組中的單拷貝基因；室溫放置一周，活性無明顯改變。

適用范圍：一般DNA片段的擴(kuò)增、DNA標(biāo)記、DNA序列測定。

建議的PCR反應(yīng)體系：（以50μl反應(yīng)體系為例）

50 μl PCR反應(yīng)體系中模板DNA推薦使用量

建議的PCR反應(yīng)條件

注意事項(xiàng)：

1、本產(chǎn)品提供的酶量可進(jìn)行多次反應(yīng)，配置過程應(yīng)將酶盡量放在冰上進(jìn)行。

2、PCR的反應(yīng)液請?jiān)诒吓渲疲缓笾糜?/span>PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。這種冷啟動(dòng)法（Cool Start Method）可增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性，減少PCR過程中的非特異性反應(yīng)，能得到良好的PCR結(jié)果。

3、PCR反應(yīng)后，無需額外加入DNA Loading Buffer，可直接加入凝膠孔進(jìn)行電泳。

可能出現(xiàn)的問題及解決方案：

1．假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備②引物的質(zhì)量與特異性③酶的質(zhì)量④PCR循環(huán)條件。尋找原因應(yīng)逐個(gè)排除。

2．假陽性
　　出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。原因可能是引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

3．出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg²⁺濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。Mg²⁺濃度或者重新設(shè)計(jì)引物即可解決。

4．出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg²⁺濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。也需逐個(gè)排除。