免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑  (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三種最常用。

實(shí)驗(yàn)方法原理

根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。    

實(shí)驗(yàn)材料

石蠟切

試劑、試劑盒

PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強(qiáng)劑酶標(biāo)抗鼠 兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺

儀器、耗材

烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管

實(shí)驗(yàn)步驟

1.  石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

2.  取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）

3.  每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

4.  除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。

5.  PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

6.  除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。

7.  除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察5分鐘。

8.  蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

閱讀：  2016-12-12 09:01:03