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1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、血清、蜂蜜、牛奶等樣本中的磺胺類藥物（SulfonamideS，SAS），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的磺胺類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min。
2.3 檢測(cè)下限：
組織（高檢測(cè)限方法）……………………0.5ppb
組織（低檢測(cè)限方法）……………………2.5ppb
血清、尿液………………………………2ppb
蜂蜜………………………………………0.5ppb
牛奶………………………………………10ppb
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板96孔
標(biāo)準(zhǔn)品（綠蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標(biāo)準(zhǔn)品（紅蓋）：1ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）10ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）7ml
底物液A（白蓋）7ml
底物液B（黑蓋）7ml
終止液（黃蓋）7ml
20X濃縮洗滌液（透明蓋）40ml
2X濃縮復(fù)溶液（黃蓋）50ml
說(shuō)明書(shū)1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCL 、NaH2PO4·2H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
    實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：0.2M  NaOH溶液
    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解
配液2：0.02M  PB緩沖液
    稱取2.58g Na2HPO4·12H2O和0.44g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。
配液3：0.5M鹽酸溶液
    4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。
配液4：乙腈-二氯甲烷混合液
    V乙腈：V二氯甲烷=1:4 
配液5：樣本復(fù)溶液
    2×復(fù)溶液在使用前按1：1用去離子水稀釋。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本（高檢測(cè)限）處理方法一
1）稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入8ml乙腈-二氯甲烷混合液，振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min；
2）移取4ml上層清澈有機(jī)相至干燥容器中，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
3）加入1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml。混合30s，15℃4000r/min以上離心5min；
4）去除上層正己烷，取20?l下層用于分析。  樣本稀釋倍數(shù)：1
5.3.2 組織樣本（高檢測(cè)限）處理方法二
1）稱取3±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入3ml 0.02M PB緩沖液充分振蕩混勻，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振蕩10min，于15℃4000r/min以上速度離心10min；
2）移取2ml上層液體（約相當(dāng)于1g的樣本）在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?nbsp;
3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加入1ml樣本復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩1min，15℃4000r/min，離心5min； 
4）除去上層正己烷，取下層20?l用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 
5.3.3 組織樣本（低檢測(cè)限）處理方法
1）稱2.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入8ml 0.02M PB緩沖液，震蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min； 
2）取20?l液體用于分析。樣本稀釋倍數(shù): 5  
5.3.4 血清樣本處理方法 
1）將血樣本于室溫放置30min，于15℃4000r/min以上離心10min，分離出血清或過(guò)濾血清；
2）取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合，混合30s；
3）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數(shù)：4
5.3.5 蜂蜜樣本處理方法
1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M 鹽酸 置于37℃環(huán)境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心10min；
3）取2ml上層液體于50℃下氮?dú)獯蹈桑?.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；
4）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數(shù)：1
5.3.6 尿樣本處理方法
1）用3ml 0.02 M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s； 
2）取20?l液體用于分析。  樣本稀釋倍數(shù): 4 
5.3.7 牛奶樣本處理方法
1）取1ml牛奶樣本用0.02 M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋（即20?l牛奶+380?l 0.02  M PB緩沖液），混合30s；
2）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數(shù)：20     
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本20?l/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50?l，再加抗體工作液80?l/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50?l，再加底物液B 50?l，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50?l，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×100%
    A0    
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。