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1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的鹽酸克倫特羅，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的鹽酸克倫特羅和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗鹽酸克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鹽酸克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中鹽酸克倫特羅的殘留量。

規(guī)格：96T/盒

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：  0.05ppb(ng/ml)
2.2 檢測下限：
尿液樣本……………………………… 0.05ppb
組 織（處理法一）…………………… 0.2ppb
組 織（處理法二）…………………… 0.05ppb
飼料樣本 ………………………………0.5ppb 
2.3 交叉反應(yīng)率：
克倫特羅（Clenbuterol）  ……………… 100%
特普他林（Terbutalin）   ……………… <1%
馬布特羅(Mabuterol)     ……………… <1%
溴布特羅(Brombuterol)   ……………… <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） ……………… <1%
萊克多巴胺（Ractopamine）……………… <1%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板………………………………96孔/板
標(biāo)準(zhǔn)液（綠蓋）：0 ppb、0.05ppb、0.15ppb、 0.45ppb、 1.35ppb、 4.05ppb…………………………………………各1ml    
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml
酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………7ml
抗體工作液 (藍(lán)蓋)………………………7ml
底物液A (白蓋)…………………………7ml
底物液B(黑蓋) …………………………7ml
終止液(黃蓋) ……………………………7ml
20X濃縮洗滌液(透明蓋)………………40 ml
10X復(fù)溶液(黃蓋)…………………………50 ml
說明書 …………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l
4.3 試劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉
5 溶液的配制
5.1 試驗前用去離子水將20X濃縮洗滌液稀釋成工作洗滌液。（19份離子水+1份20X濃縮洗滌液）
5.2 試驗前用去離子水將10X復(fù)溶液稀釋成工作復(fù)溶液。（9份離子水+1份10X復(fù)溶液）
5.3 0.1M HCl 溶液：取0.86ml濃HCl加去離子水至100ml。
5.4 0.1M NaOH 溶液：稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。
5.5 乙腈-0.1M HCl 溶液：V乙腈:V 0.1 HCl =84:16
6 樣本前處理方法
實(shí)驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗結(jié)果。
6.1 尿樣本處理方法
    直接取50?l清亮尿樣進(jìn)行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
6.2 組織樣本處理方法一
   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復(fù)溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50?l上清液進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.2ppb
6.3 組織樣本處理方法二
稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml乙腈-0.1M HCl，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min。
取上清液3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min，取全部上清在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?br/>    加入1ml 復(fù)溶液混合振蕩30s，取50?l進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
6.4 飼料樣本處理方法
稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；
吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮?dú)獯蹈桑? ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min。
取50?l下層進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.5ppb
7 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
7.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
7.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50?l/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50?l/孔，再加入50?l /孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。
7.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7.4 顯    色：每孔加入底物液A 50?l，再加底物液B 50?l，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
7.5 終    止：每孔加入終止液50?l，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
7.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。
8 結(jié)果分析
8.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×100%
    A0    
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。