通用名 非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒商品名 無

英文名 African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

漢語拼音 Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jianceshijihe

【主要成分與含量】

【作用與用途】 用于全血、血清、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、扁桃體、肺、肌肉、環(huán)境樣品等樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品采集及處理

1.1.1 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清 5 ml。

1.1.2 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2～8℃低溫運至實驗室用于檢測。

1.1.3 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料、污水樣品。2～8℃低溫運至實驗室用于檢測。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 脾、肺、腎等組織樣品處理方法 取適當(dāng)大小的組織塊放入盛有 PBS 緩沖液的研磨管中，6000 r/min 震蕩研磨 45 秒，制成約 10%的組織勻漿液，5000 r/min 離心 5 分鐘，取200μl 上清液進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 糞便、飼料樣品處理方法 取適量的糞便、飼料放入盛有 PBS 緩沖液的研磨管中，

6000 r/min 震蕩研磨 45 秒，制成約 10%的勻漿液，5000 r/min 離心 5 分鐘，取 200 μl 上清液進(jìn)行核算提取。

1.2.3 污水樣品處理方法 直接取 200 μl 污水進(jìn)行核酸提取。

1.3 樣品核酸提取 采用 DNA 提取試劑盒或自動核酸提取儀提取各類樣品中的核酸。低溫保存待檢。

1.4 PCR 擴(kuò)增 將試劑盒置室溫使熒光 PCR 酶混合液、引物探針、陰性對照和陽性對照完全溶解，并混勻。

1.4.1 將引物探針（棕色管）和熒光 PCR 酶混合液瞬時離心后，將熒光 PCR 酶混合液全部移至引物探針（棕色管）中，顛倒混勻 6 次，充分混勻，配制成 PCR 反應(yīng)液。

1.4.2 取 18 μl PCR 反應(yīng)液至每個反應(yīng)管內(nèi)，然后加 2 μl 所提取的樣品核酸，每個反應(yīng)總體積為 20 μl。每次檢測應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。在熒光 PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測。

1.5 反應(yīng)程序

37℃孵育 2 分鐘，95℃預(yù)變性 5 分鐘；95℃變性 15 秒，58℃退火延伸 1 分鐘，45 個循環(huán)， 在每一循環(huán)的 58℃時收集 FAM 熒光信號。

2 結(jié)果判定

2.1 陽性對照的 Ct 值應(yīng)＜35 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照應(yīng)無 Ct 值或 Ct 值≥40 且無特異性擴(kuò)增曲線，試驗結(jié)果有效；否則應(yīng)重新進(jìn)行試驗。

2.2 被檢樣品 Ct 值＜40 且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為陽性；當(dāng)無 Ct 值或 Ct 值≥40， 判為陰性。

【注意事項】 （1） PCR 檢測的每一步都應(yīng)在專門區(qū)域或地點進(jìn)行。

（2） 使用前應(yīng)將熒光 PCR 酶混合液、引物探針、陰性對照和陽性對照完全溶化，充分振蕩混勻，瞬時離心，盡量吸取液體上層。

（3） 試劑盒不同組分間不得交叉，防止污染。

（4） 避免反復(fù)凍融。

（5） PCR 產(chǎn)物均應(yīng)合理處理，以免造成污染。

（6） 嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行操作。

（7） 按要求貯藏，冷鏈運輸；并在有效期內(nèi)使用。

【規(guī)格】 50 次/盒

【貯藏與有效期】 -20℃以下保存，有效期為 15 個月。

僅供獸醫(yī)診斷使用