嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，是單端孢菌素烯烴中的一種，其通常是由生長(zhǎng)在谷類物品(如小麥、玉米、大麥和秣草)霉菌鐮紅菌素生成的。嘔吐毒素DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人、動(dòng)物在誤食被嘔吐毒素污染的糧食谷物后可能產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素DON可能與人類食管癌、IgA腎病有關(guān)，對(duì)人類、動(dòng)物的健康均構(gòu)成威脅。人畜攝入了被嘔吐毒素DON污染的食物／飼料后，會(huì)出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)變得遲鈍等急性的中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)可損害造血系統(tǒng)造成死亡。研究表明，嘔吐毒素DON可能對(duì)免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。由于嘔吐毒素DON的危害嚴(yán)重，引起了各國(guó)的普遍重視。谷物及飼料中嘔吐毒素DON的含量有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料、泌乳期動(dòng)物配合飼料中嘔吐毒素DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0mg／kg，牛配合飼料、家禽配合飼料中嘔吐毒素DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為5.0mg／kg。

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：嘔吐毒素檢測(cè)儀、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物（大米、玉米、小米等）及飼料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml去離子水，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.1ml上清，加入0.9ml復(fù)溶液，混勻；

3）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：50    檢測(cè)下限：150ppb

6 嘔吐毒素檢測(cè)儀酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50?l/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50?l/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100?l/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50?l/孔，再加底物液B 50?l/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：加終止液50?l/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測(cè)吸光值：用CSY-E96D嘔吐毒素檢測(cè)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

 百分吸光度值（%）＝

A

×100%

A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

閱讀：  2019-06-25 17:43:38