一、目的與意義
學(xué)習(xí)使用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA，使學(xué)生掌握DNA分子進(jìn)入細(xì)胞的原理和實驗操作技術(shù); 掌握PCR法快速鑒定重組載體的基本操作。
二、實驗原理
轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒DNA或構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程。細(xì)菌細(xì)胞在低溫，低滲（CaCl2溶液）中膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面。經(jīng)42℃短時間熱激處理后，促進(jìn)了細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需要對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定，通過α互補(bǔ)進(jìn)行篩選是最常用的鑒定方法之一。
目前實驗使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啟動子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ基因。lacZ 基因編碼的α肽鏈與失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，產(chǎn)生具有功能活性的β半乳糖苷酶分子，這種現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。在IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）的誘導(dǎo)下，β半乳糖苷酶能將X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和藍(lán)色的底物5-溴-4-靛藍(lán)。因此，任何攜帶lacZ基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，都會在涂有IPTG和X-Gal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落。當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位點后，就破壞了α肽鏈的閱讀框，從而無法形成α互補(bǔ)，不能產(chǎn)生具有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重組子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培養(yǎng)基平板上是白色菌落。
PCR法快速鑒定重組載體的基本原理是直接用菌液為摸板，通過特異引物的擴(kuò)增來鑒定外源片段是否重組。
三、實驗儀器 PCR技術(shù)討論版  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html

四、實驗材料
1、1.5 ml離心管
2、無菌槍頭20 μL各2支
3、PCR管
五、實驗試劑
1、溴酚蘭加樣緩沖液（6×）: 溴酚蘭0.25%，蔗糖40%
2、溴化乙錠（10 mg/ml）
3、5×TBE：Tris 堿54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na2·2H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 ml。高壓濕熱滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ们跋♂屩?.5×。
4、PCR所用試劑同
5、dNTP Mix (上海生工)
6、Taqase plus（北京鼎國）
7、模板DNA：20 ng/µL
8、引物（委托上海生工合成，經(jīng)離心，用無菌ddH2O稀釋成20 nmoI/L

9、10×Taqase plus緩沖液
10、無菌ddH2O
 

閱讀：  2013-10-15 17:19:28