1.如何測(cè)定引物的OD值？

用紫外分光光度計(jì)在260nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度來(lái)定量，請(qǐng)注意紫外分光光度計(jì)的使用，測(cè)定時(shí)溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會(huì)有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色皿中測(cè)定其吸光度，即為所測(cè)體積的OD值，進(jìn)而可以計(jì)算出母液的OD值。
舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色杯中測(cè)定的吸光度為0.25，說(shuō)明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說(shuō)明原來(lái)1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎樣溶解引物？

我們的的合成報(bào)告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實(shí)驗(yàn)需要加入適量的無(wú)核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開(kāi)啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失。

3.合成的引物應(yīng)如何保存?

沒(méi)有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲(chǔ)存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復(fù)多次凍融會(huì)降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4.如何檢測(cè)引物的純度？

實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個(gè)堿基的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的(有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，乃是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶)。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團(tuán)嗎?

沒(méi)有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，訂貨時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注明，此時(shí)需收取磷酸化的費(fèi)用。

6.合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦?

PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。
1) 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu).
3) PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應(yīng)條件是否合適?
如果一切正常，還無(wú)法解決問(wèn)題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物。

7.測(cè)定了引物的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?

由于核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時(shí)，常用A260/A280比值來(lái)評(píng)價(jià)核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個(gè)堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì)大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來(lái)判斷引物的純度.

8.如何將兩條互補(bǔ)的單鏈退火形成雙鏈？

用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應(yīng)？ 一般來(lái)講，20個(gè)堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應(yīng)。 15.引物在常溫下運(yùn)輸，會(huì)降解嗎？ 不會(huì)降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì)降解。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數(shù)混合，總體積不要超過(guò)500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。

9.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?

對(duì)引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。

10.能否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對(duì)合成的引物進(jìn)行定量?

不能。因?yàn)镋B是通過(guò)嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過(guò)自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來(lái)對(duì)合成的DNA進(jìn)行定量。

11.2OD的引物可以多少做次PCR反應(yīng)？

一般來(lái)講，20個(gè)堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應(yīng)。
12.引物在常溫下運(yùn)輸，會(huì)降解嗎？
不會(huì)降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì)降解。

13: 合成的熒光標(biāo)記探針應(yīng)如何保存?

1.熒光探針必須避光保存。
2.干品請(qǐng)于-20℃保存。
3.強(qiáng)烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)。通常，將探針配制成100 pmol/ul的儲(chǔ)備液，分裝成幾份 (避免反復(fù)凍融)，于-20℃保存。使用前，將配制好的儲(chǔ)備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

14: 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長(zhǎng)度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

1.A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
2.DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長(zhǎng)鏈Oligo DNA之間差別較小。

15: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，為什么?

如果測(cè)序后引物處出現(xiàn)了問(wèn)題，不排除PCR錯(cuò)配的可能，但更主要的原因應(yīng)在合成引物本身。在引物合成過(guò)程中，除了人為將序列輸錯(cuò) (可核對(duì)合成報(bào)告單)，化學(xué)合成方法本身不可避免地會(huì)產(chǎn)生失敗序列，具體分析如下：
1.由于DNA合成是從3′→5′端一個(gè)堿基一個(gè)堿基地連接上去的，每連接上一個(gè)堿基，都需要多步化學(xué)反應(yīng) (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱(chēng)之為一個(gè)循環(huán)。Coupling是上一個(gè)堿基的5′OH 與下一個(gè)堿基的3′活性部分發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達(dá)99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過(guò)Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；
2.Capping是將沒(méi)有連接上下一個(gè)堿基的5′-OH乙酰化，阻止其進(jìn)一步延伸。Capping的效率不可能達(dá)到100%，沒(méi)有被Cap的5′OH會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；
3.Detritylation是將上一個(gè)堿基5′OH上的保護(hù)基脫掉，準(zhǔn)備連接下一個(gè)新堿基，脫保護(hù)的效率也很難達(dá)到100%，沒(méi)有脫保護(hù)的5′OH會(huì)跳過(guò)該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；
4.在Coupling步驟中，新堿基(活性狀態(tài))在沒(méi)有與上一個(gè)堿基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)前發(fā)生自身連接，造成多堿基的失敗序列；
5.合成時(shí)堿基G可能會(huì)轉(zhuǎn)化成烯醇式異構(gòu)體，PCR擴(kuò)增時(shí)被DNA聚合酶識(shí)別作A，發(fā)生 G到A的轉(zhuǎn)換。
上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過(guò)純化不同程度地得到去除。對(duì)40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是PAGE；而對(duì)40 mer以上的DNA制品PAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對(duì)PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，一定要選擇PAGE純化或HPLC純化的引物。

16: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，怎么辦?

1.因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?00%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請(qǐng)重新挑選一個(gè)克隆測(cè)序，會(huì)得到正確的結(jié)果。
2.如果挑選2 ~ 3個(gè)克隆測(cè)序情況還沒(méi)改觀(guān)，我們會(huì)免費(fèi)重新合成引物。

17: 進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)個(gè)月不成功，后經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物處有錯(cuò)誤，怎么辦?

1.表達(dá)實(shí)驗(yàn)之前一定要對(duì)DNA序列進(jìn)行驗(yàn)證。
2.我們可以免費(fèi)重新合成引物。
3.如進(jìn)行索賠時(shí)，按國(guó)際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內(nèi)。

18: G到A的轉(zhuǎn)換。 上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過(guò)純化不同程度地得到去除。對(duì)40 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?

1.合成Oligo DNA時(shí)，選用高純度級(jí)制品。
2.避免使用過(guò)長(zhǎng)的Oligo DNA，最好選用小于35 mer的合成DNA制品。
3.進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次克隆都須進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，尤其需要注意。

19: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?

由于一般的PCR用引物的5′末端都沒(méi)有磷酸基團(tuán)，因此，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的5′末端也沒(méi)有磷酸基團(tuán)。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，無(wú)法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，背景會(huì)極高。此時(shí)請(qǐng)對(duì)PCR產(chǎn)物的5′端進(jìn)行磷酸 (PO4修飾) 化處理。

20: 進(jìn)行反義核酸實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否要對(duì)DNA鏈全部進(jìn)行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性?

DNA經(jīng)S代修飾后比較穩(wěn)定，在細(xì)胞中不會(huì)被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但會(huì)降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結(jié)合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數(shù)個(gè)(通常3個(gè))S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩(wěn)定性，又能增加反義DNA與靶序列的結(jié)合能力。不過(guò)如果要將反義DNA注入到活的動(dòng)物體內(nèi)，為增強(qiáng)穩(wěn)定性，還是將整條鏈S代效果更好。
2’ O-Me (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。 此外，5-Me-dC由于能增強(qiáng)DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，有時(shí)也被摻入到S代的反義核酸中。 RNA也阻抗核酸酶降解，可與S代DNA構(gòu)成嵌合的反義核酸，這樣既能增強(qiáng)反義核酸的穩(wěn)定性，又能增加其與靶序列的親和性 (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。
此外，5-Me-dC由于能增強(qiáng)DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，有時(shí)也被摻入到S代的反義核酸中。

21: FITC、6-FAM、5-FAM標(biāo)記之間有何區(qū)別?

它們皆是熒光素標(biāo)記 (Fluorescein)，三者結(jié)構(gòu)間的區(qū)別如下：
從結(jié)構(gòu)圖可見(jiàn)，5-FAM與6-FAM互為異構(gòu)體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團(tuán)均為熒光素，通常使用中沒(méi)有區(qū)別。

22: 淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標(biāo)記熒光探針在使用上有什么不同?

由淬滅基團(tuán)TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標(biāo)記熒光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱(chēng)"TaqMan"探針，用于Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。由于這些淬滅染料的光譜學(xué)性質(zhì)不同(見(jiàn)下圖)，作為淬滅基團(tuán)使用時(shí)的特點(diǎn)也不同，現(xiàn)說(shuō)明如下：
1.TAMRA為熒光染料，在淬滅報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)，自身會(huì)在更高波長(zhǎng)處發(fā)射熒光，此發(fā)射熒光會(huì)對(duì)報(bào)告基團(tuán)的檢測(cè)造成影響，探針熒光本底 (Background)相對(duì)較高。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報(bào)告基團(tuán)，但自身不發(fā)射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測(cè)靈敏度更高。
2.淬滅基團(tuán)對(duì)報(bào)告基團(tuán)的淬滅有賴(lài)于二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報(bào)告基團(tuán)的熒光光譜應(yīng)與淬滅基團(tuán)的吸收光譜相交搭。對(duì)比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見(jiàn)TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報(bào)告基團(tuán)種類(lèi)比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報(bào)告基團(tuán)種類(lèi)很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報(bào)告基團(tuán)種類(lèi)更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標(biāo)記熒光探針用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

23: TaqMan 探針設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循哪些原則?

1.探針應(yīng)位于兩引物之間；
2.探針中堿基G、C的含量應(yīng)在20%～80%之間；
3.避免同種堿基成串出現(xiàn)，特別是堿基“G”；
4.堿基G不要出現(xiàn)在5’末端；
5.探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應(yīng)在68～70℃之間；
6.探針長(zhǎng)度超過(guò)30個(gè)堿基時(shí)，最好把淬滅基團(tuán)放在中間，以防止熒光本底過(guò)高，這時(shí)探針的3’末端應(yīng)加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應(yīng)過(guò)程中延伸。

24: 何謂分子信標(biāo) (Molecular Probes)？與普通的雙標(biāo)記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什么特殊性？

Molecular Probes是一類(lèi)特殊的雙標(biāo)記探針，通常狀態(tài)下，其兩末端互補(bǔ)配對(duì)，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu))，發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)迫使分別連在兩末端的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊密鄰近 (此時(shí)檢測(cè)不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，Molecular Probes變得明亮起來(lái)，可檢測(cè)到熒光。由于發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，探針對(duì)靶序列檢測(cè)的特異性增強(qiáng)，相對(duì)于普通的雙標(biāo)記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對(duì)SNP有更強(qiáng)的識(shí)別能力，能區(qū)分序列上僅相差一個(gè)堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測(cè)。此外，Molecular Probes也應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi)的mRNA雜交、RNA加工、及轉(zhuǎn)錄過(guò)程的時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)研究等。

閱讀：  2014-07-17 15:45:02