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有效期：1年

別名：鎳-瓊脂糖凝膠6FF；鎳瓊脂糖凝膠鎳柱

英文名稱：NiSepharose6FF

儲存條件：2-8℃，有效期1年

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得.它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有極高的親和力，可達(dá)5-20mg/ml。可在非變性和變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白。純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達(dá)95％。Ni-NTA可再生4-6次，重復(fù)使用。本產(chǎn)品懸浮液為20％乙醇，已螯合Ni2+。

操作方法：

A.非變性條件下抽提His標(biāo)簽蛋白

1)準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2)加入1/20細(xì)胞生長體積的NTA-0Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3)將細(xì)胞懸浮起來，加入溶菌酶，混勻，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。

4)加入10%TritonX-100,使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。

5)12000 rpm/min(20,000×g以上)，4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6)將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0Buffer洗。

7)將樣品加至NTA層析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況。

8)層析用5倍NTA體積的NTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。

9)分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000Buffer洗脫，流速控制在15ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。

10)確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。NTA-0、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20mMTris-HCl pH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000mMImidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標(biāo)簽蛋白

1)準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2)加入1/20細(xì)胞生長體積的GuNTA-0Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3)將細(xì)胞懸浮起來，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。

4)室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。

5)12000轉(zhuǎn)/分（20,000×g以上），4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6)將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0Buffer洗。

7)將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。

8)層析用5倍NTA體積的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。

9)分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫，流速在15ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。

10)確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。

12)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則。

GuNTA-0、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10%Glycerol,6M GuanidiumHCl添加0、20、40、60、100、500mM Imidazole。

C.NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用若干次數(shù)（3-5次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦徊皆偕芤毫鞲珊螅偌酉乱徊皆偕芙狻?/p>

用戶需要自行準(zhǔn)備25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去離子水。從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的StrippingSolutionI、2倍體積的去離子水、3倍體積的StrippingSolutionII、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的StrippingSolutionIII、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用，用5倍體積的NiChargingSolution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0Buffer）洗；如果想長期儲存，加入1倍體積的20%乙醇，4°C保存，使用前用5倍體積的NiChargingSolution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0Buffer）洗

再生溶液配方：

StrippingSolutionI:  6MGuHCl,0.2Maceticacid。

StrippingSolutionII: 2%SDS。        

StrippingSolutionIII: 100mMEDTA,pH8.0。

NiChargingSolution: 100mM NiSO4